上期在《水产 | 酵母细胞壁在甲壳动物中的运用(一)》一文中，介绍了Phileo的明星产品酵母细胞壁——赛福多糖Safmannan®，可以有效提升甲壳动物的免疫力。

南美白对虾(Penaeus vannamei)长期使用赛福多糖Safmannan®后，对抵御副溶血性弧菌感染有没有作用？一般使用的剂量为多少？

为了研究这个课题，Phileo和越南芹苴大学合作进行了一项试验：

在饲料中添加三种剂量的赛福多糖Safmannan®，投喂一段时间后，用副溶血弧菌对南美白对虾进行攻毒，对比攻毒前后各组免疫指标的变化及攻毒后存活率的差异。

该篇文章在《AQUA Culture Asia Pacific》杂志上发表

试验设计

南美白对虾由「越南芹苴大学水产养殖和渔业学院」的虾苗场提供，规格为2-3g/只。

在进行试验前，为对虾进行白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)的筛查，以确保它们没有携带这些病原体。

该试验在芹苴大学的试验室中的玻璃缸(容积为30L)中进行，养殖过程中保持水量占玻璃缸容积的70%，海水盐度25ppt，温度控制在28-30℃左右。

每组设置3个重复，每个重复即一个玻璃缸，每个玻璃缸中投放30只对虾。

试验饲料制备及分组

本次试验设置了三个对照组及三个试验组，各组赛福多糖Safmannan®添加量不同或攻毒处理有差异，具体分组信息见表1。

投喂试验两周后取样，进行攻毒试验。

表1 试验分组信息

攻毒试验

攻毒试验使用的是一株会造成AHPND的副溶血性弧菌(使用常规生化试验、API 20E和PCR等方法鉴定)(Nguyen等人，2014)。

每个攻毒的玻璃缸准备150mL的细菌培养液，用分光光度计测定细菌细胞光密度值，将菌悬液调整至108/mL的浓度。

将对虾浸泡在细菌培养液中保持通氧气，15分钟后添加海水，使细菌密度降低到106/mL。

对虾在攻毒后观察3周，记录症状和死亡率。在攻毒后的2天内不换水，随后余下的试验时间里，每天换水量增加到20%。在整个攻毒期间，所有组均保持投喂商业饲料。

攻毒试验

检测项目

试验结束后，对以下参数进行了分析：

1. 攻毒后的对虾的外观及肝胰腺组织切片
2. 攻毒后21天存活率(%)
3. 酚氧化酶原(PO)活性

*所有数据采用Excel和SPSS软件进行统计分析。

试验结果

攻毒后各组对虾的外观特征

攻毒后3天南美白对虾的外观和肝胰腺(HP)情况如图2和图3所示。

两个未攻毒对照组(阴性对照组和赛福多糖Safmannan®组)的南美白对虾表现相对健康，肝胰腺的状况很好，肠道内容物充盈(图2)。

图2 对照组的对虾明显健康

经过攻毒的阳性对照组和其他试验组中的对虾均表现出典型的EMS的迹象，包括不正常的游泳姿态，有些对虾沉在缸底活力差，对虾壳软，肠道的内容物不充盈，肝胰腺出现明显变黑或苍白的颜色(图3)。

图3 阳性对照组(用副溶血弧菌攻毒)对虾的外观特征和肝胰腺

组织学检测

收集未攻毒组的健康对虾和攻毒组的濒死对虾，进行组织学分析。

未攻毒组的健康对虾肝胰腺明显优异于攻毒组，可以清晰地看到分泌细胞(B细胞)、吸收细胞(F细胞)、储存细胞(R细胞)和胚细胞(E细胞) (图4)。

图4 试验南美白对虾的健康肝胰腺(20X和40X)

而攻毒组的濒死对虾，表现出肝胰腺细胞功能障碍，缺乏E、B和R细胞，肝胰腺小管上皮脱落和明显的近端血细胞炎症(图5)。组织病理学病变与Lightner(2012年)和Loc等人(2013年)描述的典型EMS病理相似。

图5 攻毒组对虾的肝胰腺照片
肝胰腺细胞功能紊乱，缺乏E、B和R细胞。肝胰腺小管上皮脱落，呈现出明显的血细胞性炎症(10X和20X)

攻毒后3周的存活率

攻毒后3周，阳性对照组的存活率显著低于其余各组(图6)。

两个未攻毒的对照组，对虾的存活率没有显著差异，存活率在90.3%到90.7%之间。

添加赛福多糖Safmannan®2kg/t和5kg/t的试验组，对虾存活率显著高于阳性对照组，而添加0.5kg/t赛福多糖Safmannan®的试验组存活率在数值上高于阳性对照组，但是统计学上没有显著差异。

图6 攻毒后3周对虾的存活率

攻毒21天后，未使用赛福多糖Safmannan®的阳性对照组的对虾存活率下降至38.9%，低于所有添加了赛福多糖Safmannan®的组(存活率在54.2% ~ 63.9%)。

总体而言，使用赛福多糖Safmannan®可以有效改善对虾感染副溶血性弧菌后的存活率。

酚氧化酶原活性

攻毒处理的阳性对照组的酚氧化酶原(PO)活性，在攻毒后相较试验开始前出现明显下降。

而未攻毒的阴性对照组酚氧化酶原(PO)活性，在攻毒后相较试验开始前没有显著变化，可以看出攻毒对酚氧化酶原(PO)活性有很大影响。

三个试验组及赛福多糖Safmannan®组，均添加了不同剂量的赛福多糖Safmannan®，从试验结果可以看出，这四个组的南美白对虾在投喂2周后，酚氧化酶原(PO)活性相比试验开始前显著提升。

另外结合赛福多糖Safmannan®组的结果，发现摄食2周赛福多糖Safmannan®对酚氧化酶原(PO)活性有显著提升，但是再持续投喂3周普通饲料，酚氧化酶原(PO)活性又回到试验开始前的水平。

图7 试验对虾在不同取样时间间隔的酚氧化酶原活性(单位/分钟/毫克蛋白)

由此判断赛福多糖Safmannan®对酚氧化酶原(PO)活性有明显的提升，但是当停止使用一段时间，酚氧化酶原(PO)活性又会回落到较低水平。

将三个试验组和阳性对照组进行对比，投喂前各组的酚氧化酶原(PO)活性没有差异，但投喂试验结束后，添加赛福多糖Safmannan®的三个试验组的酚氧化酶原(PO)活性均显著高于对照组。

在攻毒后，三个试验组的酚氧化酶原(PO)活性依旧高于阳性对照组，但是添加了2kg/t和5kg/t赛福多糖Safmannan®的两个试验组，数值高于0.5kg/t赛福多糖Safmannan®组。

结论

结果表明，在AHPND攻毒后，添加赛福多糖Safmannan®能使对虾保持较高的酚氧化酶原(PO)活性，并提高存活率。

这次试验还表明，酵母细胞壁可以迅速提升免疫力，添加2周剂量为2kg/t的赛福多糖Safmannan®，可以更有效地提高对虾的存活率并改善免疫力。